三維基因組結(jié)構(gòu)與表觀遺傳修飾是調(diào)控基因表達的重要機制，其動態(tài)變化與發(fā)育、細胞命運決定及癌癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。測序技術(shù)與固定細胞熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）等方法極大推動了三維基因組互作的研究，但這些方法多依賴固定樣本，難以反映染色質(zhì)在活細胞中的實時動態(tài)變化。實現(xiàn)基因組在活細胞內(nèi)的時空可視化是理解基因調(diào)控動態(tài)的關(guān)鍵?，F(xiàn)有基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的活細胞成像技術(shù)雖能靶向內(nèi)源基因序列，但在非重復(fù)序列標記、多位點同時成像及原代細胞應(yīng)用方面仍存在靈敏度不足、系統(tǒng)復(fù)雜度高等難點。

　　研究團隊在此前CRISPR LiveFISH技術(shù)的基礎(chǔ)上進行了系統(tǒng)性升級，首次在CRISPR系統(tǒng)的引導(dǎo)RNA（sgRNA）標記中引入拓展遺傳字母表中的正交非天然堿基對（unnatural base pairs, UBPs），結(jié)合Cas9/sgRNA結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的理性設(shè)計，實現(xiàn)了位點特異性的sgRNA熒光標記，顯著提升了染色質(zhì)活細胞成像的靈敏度和信噪比。PRO-LiveFISH可同時實現(xiàn)多達6個基因位點的多色動態(tài)觀測，在無需信號放大的情況下，僅使用約10條sgRNA可有效標記非重復(fù)基因位點，適用于包括原代細胞在內(nèi)的多種細胞類型。

　　利用PRO-LiveFISH技術(shù)，研究團隊成功實現(xiàn)了活細胞內(nèi)多基因位點的動態(tài)觀測，系統(tǒng)探索了表觀修飾和染色質(zhì)互作相關(guān)的動態(tài)調(diào)控規(guī)律。首先，通過比較不同細胞狀態(tài)、不同細胞類型中同一基因位點的運動行為，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)運動狀態(tài)與其表觀修飾水平密切相關(guān)：活躍的組蛋白修飾（如乙?；┏０殡S著受限的位點運動，而乙?；较陆祫t伴隨更高的位點動態(tài)。通過對特定增強子及其靶基因進行同步動態(tài)標記，研究發(fā)現(xiàn)它們在動態(tài)運動中依然能保持持續(xù)的空間鄰近，說明這一基因位點的增強子-啟動子（E-P）互作在時空維度上具有相對穩(wěn)定性。最后，通過對超級增強子及其靶基因的追蹤，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4在維持此類三維互作中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當BRD4活性受到抑制時，超級增強子及其靶基因的空間距離顯著增加，表明了相應(yīng)的三維互作的解離。這些發(fā)現(xiàn)從動態(tài)視角闡釋了轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4對三維基因組的調(diào)控機制。

　　綜上， CRISPR PRO-LiveFISH通過結(jié)合拓展遺傳字母技術(shù)與sgRNA理性設(shè)計，為動態(tài)三維基因組研究提供了靈活高效的活細胞多色成像平臺。該技術(shù)不僅適用于非重復(fù)DNA序列的動態(tài)標記，也可應(yīng)用于原代細胞增強子-啟動子互作的標記。 借助該工具，研究團隊探索了染色質(zhì)動態(tài)與表觀遺傳之間的相互關(guān)聯(lián)、解析了增強子-啟動子互作的時空特性，并闡釋了轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4在維持超級增強子三維互作中的關(guān)鍵作用，從而深化了對表觀調(diào)控和三維基因組時空動態(tài)調(diào)控機制的理解。

　　清華大學生命科學學院王海峰研究員、頡偉教授以及中科院生物物理所方顯楊研究員是本文的共同通訊作者。清華大學2019級博士生劉美鑠、2022級博士生黃可韻和2020級博士生張杰（已畢業(yè)）為共同第一作者。西湖大學于洪濤教授、戚樹濤研究員，清華大學博士后杜振海（現(xiàn)中科院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心研究員），以及清華大學2019級博士生胡梁?。ㄒ旬厴I(yè)）、2021級博士生李青陽、2022級博士生王新銘、2021級博士生顧卜銘、2023級博士生唐昊、2021級博士生馬宇等對研究做出重要貢獻。研究工作得到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部項目、國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項、北京市自然科學基金、清華—北大生命科學聯(lián)合中心、疑難重癥及罕見病全國重點實驗室自主研究課題、清華大學自主科研計劃、本源公益基金、新基石科學基金等項目的支持。kaiyun開云kaiyun開云