這是一篇針對實驗室萌新寫的關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)的詳細介紹，對于實驗室老手也建議收藏轉(zhuǎn)發(fā)給師弟師妹，這樣省心省力，又能節(jié)省大量講解時間，這不香么？簡單來講，CRISPR-Cas9是一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過這種技術(shù)科研人員可以對細胞和生物體內(nèi)的基因進行編輯。所謂的基因編輯就是通過某種生物手段和技術(shù)，對生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)進行修改。

　　這是一篇針對實驗室萌新寫的關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)的詳細介紹，對于實驗室老手也建議收藏轉(zhuǎn)發(fā)給師弟師妹，這樣省心省力，又能節(jié)省大量講解時間，這不香么？

　　人體有著一套復(fù)雜且高效的免疫系統(tǒng)，時刻保護著我們免受病毒和細菌的攻擊。但是，對于弱小又無助的原核細胞而言，它們也是急切需要被保護的。為此，經(jīng)過幾億年的進化，細菌和大部分古細菌衍生出了CRISPR-Cas系統(tǒng)，用于保護它們免受外源DNA和噬菌體的侵染。到目前為止，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)50%的細菌和超過90%的古細菌均攜帶有CRISPR-Cas系統(tǒng)。CRISPR是一段高度重復(fù)的DNA序列，兩端重復(fù)序列之間存在著各不相同的spacer序列，表達Cas蛋白家族的基因簇位于CRISPR位點的上游，其表達翻譯的幾種類型的Cas蛋白作為原核生物免疫應(yīng)答的效應(yīng)器發(fā)揮著重要作用。

　　當(dāng)細菌受到噬菌體的侵染時，被釋放到細菌細胞質(zhì)中的噬菌體基因組的某段DNA序列被識別并整合到CRISPR的spacer區(qū)域，隨后轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的crRNA前體（pre-crRNA）。crRNA前體經(jīng)過修飾和加工，生成向?qū)NA（guide-RNA）。由于gRNA中存在一段來源于噬菌體基因組的序列，因此gRNA可以通過堿基的互補配對原則識別噬菌體的基因組。同時存在于細胞質(zhì)中的gRNA和Cas蛋白特異性結(jié)合，并靶向到噬菌體基因組參與DNA的切割與降解。

　　簡單來講，CRISPR-Cas9是一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過這種技術(shù)科研人員可以對細胞和生物體內(nèi)的基因進行編輯。所謂的基因編輯就是通過某種生物手段和技術(shù)，對生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)進行修改。

　　基于原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)研發(fā)出的CRISPR-Cas9技術(shù)只包含兩種重要的成分，一種是行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白，而另一種則是具有導(dǎo)向功能的sgRNA（single guide RNA）。當(dāng)細胞內(nèi)同時表達sgRNA和Cas9蛋白時，Cas9蛋白通過與sgRNA結(jié)合，靶向到目的DNA序列上發(fā)揮DNA雙鏈切割的功能。DNA序列被切割產(chǎn)生斷裂后，引發(fā)細胞內(nèi)部的DNA修復(fù)機制（DNA repair）。真核細胞同時存在著同源重組修復(fù)和非同源重組修復(fù)。在同源重組修復(fù)下，斷裂的染色體以另一條完整的姐妹染色單體為模板進行DNA修復(fù)，而在非同源重組修復(fù)下，斷裂出的DNA隨機修復(fù)，引入新的堿基，使基因產(chǎn)生移碼突變。

　　從很久以前，生物學(xué)家們就熱衷于一種研究策略，那就是功能缺失策略（loss of function）。常規(guī)的理解是這樣的，當(dāng)我們想要去研究某個基因在整個基因組中的作用時，只需要通過某種方法將這個基因從基因組中剔除，然后觀察去除這個基因之后，這個細胞或生物體會發(fā)生怎樣的變化，然后根據(jù)這些變化去推斷這個基因的功能?；蚯贸褪怯脕砻枋鰧⒛硞€或某些基因從基因組中剔除這件事，而基因敲除技術(shù)則是用于完成這件事的方法或技術(shù)。

　　在實際實驗過程中，我們只需要將Cas9蛋白和設(shè)計好的gRNA同時“運送”進細胞中即可，接下來的就交給細胞自己去操作了。

　　1）RNP法。直接將大量的gRNA和Cas9蛋白，通過電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染目的細胞

　　2）病毒法。構(gòu)建慢病毒（LV）敲除質(zhì)粒，經(jīng)病毒包裝和純化后轉(zhuǎn)染細胞，將sgRNA和Cas9蛋白元件整合到細胞基因組中，從而使細胞源源不斷地生產(chǎn)sgRNA和Cas9蛋白。

　　3）常規(guī)質(zhì)粒法。構(gòu)建常規(guī)敲除質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)將其導(dǎo)入細胞，短時間內(nèi)表達gRNA和Cas9蛋白。

　　4）轉(zhuǎn)座子法（PiggyBac）。將攜帶有PB轉(zhuǎn)座子和piggyBac轉(zhuǎn)座酶(PBase)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)座酶促進轉(zhuǎn)座，將高拷貝的Cas9蛋白和gRNA表達元件隨機整合到基因組，實現(xiàn)gRNA和Cas9蛋白的持續(xù)表達。

　　這四種方法各有優(yōu)劣，我們在選擇時可根據(jù)所研究的靶基因及靶細胞的特性，選取適合自己研究要求的方法。這期的分享就到此為止，相信看到這大家對CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)有了不錯的理解。

　　賽業(yè)生物作為一家綜合解決方案提供商，依托于品系豐富的基因編輯小鼠資源庫、高效且智能化的模式動物定制平臺、藥物篩選評價小鼠模型平臺、一站式小動物表型分析平臺、一站式無菌鼠技術(shù)服務(wù)平臺及先進的細胞技術(shù)服務(wù)平臺，建立了多位一體的創(chuàng)新性CRO平臺服務(wù)網(wǎng)絡(luò)，以服務(wù)于腫瘤、免疫、代謝、內(nèi)分泌、心血管、神經(jīng)及傳染病等方向的科學(xué)研究及藥物研發(fā)篩選，并與全球100多個國家和地區(qū)的數(shù)萬名科學(xué)家及企事業(yè)單位建立了廣泛的合作，產(chǎn)品與技術(shù)已直接應(yīng)用于包括CNS（Cell, Nature, Science）三大期刊在內(nèi)的4800余篇學(xué)術(shù)論文。賽業(yè)生物已獲得ISO9001:2015和AAALAC雙認(rèn)證，確保向廣大專家學(xué)者提供的所有產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)符合國際標(biāo)準(zhǔn)的同時也表達了我們尊重動物福利和倫理，重視生物安全的負(fù)責(zé)任態(tài)度。

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